نقش کلسیم در ایجاد اپوپتوزیس در نورون های حرکتی قطعات نخاع موش بالغ

کلسیم به عنوان پیامبر ثانویه نقش مهمی در پدیده های زیستی ایفا می نماید. بنابراین هومئوستازی کلسیم بعنوان یک روند کاملاًَ تنظیم شده در مایع خارج و داخل سلولی مهم است. در شرایط طبیعی غلظت کلسیم داخل سلولی کم در حالیکه تحت شرایط پاتولوژیک، غلظت داخل سلولی کلسیم افزایش می یابد. افزایش غیر طبیعی این یون در داخل سلول منجر به مرگ سلولی می شود. در این خصوص شواهد نشان می دهند که افزایش یون کلسیم منجر به اپوپتوزیس می شود. هدف از این پژوهش مطالعه نقش کلسیم در اپوپتوزیس نورون های حرکتی قطعات نخاع موش بالغ بود. در این پژوهش ناحیه ی سینه ایی نخـاع مـوشـهـای مـاده بـالـغ نـژاد balb/c با استفاده از دستگاه قطعه کننده بافت (tissue chopper) به قـطـعـات 400 میکرونی بریده شد. سپس قطعات به سه گروه 1- قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر)، 2- گروه کنترل و 3– گروه تیمار تقسیم شدند. قطعات گروه 2 و 3 به پلیت های حاوی محیط کشت انتقال و در انـکوبـاتـور co2 دار بـرای مدت زمان6 ساعت نگهداری شدند. قطعات تازه تهیه شده و کشت شده پس از فیکس توسط دستگاه cryostat برش گیری شدند. جهت ارزیابی قابلیت حیات قطعات سه گروه از سنجش mtt استفاده شد. به منظور مطالعه جنبه های مورفولوژیکی اپوپتوزیس در نورون های حرکتی، رنگ آمیزی فلورسنت شامل پروپیدیوم آیوداید و هوکست 33342 مورد استفاده قرار گرفت. الکتروفورز بر روی ژل آگاروز جهت بررسی dna در قطعات تازه تهیه و کشت شده نخاع، انجام شد. روش ایمیونوهیستوشیمی با استفاده از آنتی بادی استیل کولین ترانسفراز (acht) جهت شناسایی نورون های حرکتی استفاده شد. تعداد نورون های حرکتی حداقل 5 برش از قطعات سه گروه شمارش و توسط آزمون t مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. به منظور بررسی نقش کلسیم در اپوپتوزیس نورون های حرکتی، قطعات نخاع به طور جداگانه در حضور کلیت کننده های کلسیمی (edta و egta، mm5)، آنتاگونیست رسپتور های گلوتامیتی (mk-801، 50 ?m و cnqx، 100 ?m)، بلاک کننده کانال ها کلسیمی وابسته به ولتاژ (لوپرامید هیدروکلراید، 100 ?m) و مهارکننده مبادله کننده سدیم/کلسیم (بپریدیل هیدروکلراید، 20?m) به مدت زمان 6 ساعت انکوبه شدند. قابلیت حیات قطعات کشت شده به مدت 6 ساعت (کنترل) نسبت به قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر) به طور قابل ملاحظه ای کاهش یافت. نورون های حرکتی قطعات کشت شده به مدت 6 ساعت در مقایسه با نورون های لحظه زمانی صفر مشخصات مورفولوژیکی اپوپتوزیس شامل چروکیدگی سلولی، متراکم شدن هسته و سیتوپلاسم را نشان دادند. dna استخراج شده از قطعات کشت شده به مدت زمان 24 ساعت طرح نردبانی dna را بر روی ژل آگاروز به نمایش گذاشت. قابلیت حیات قطعات کشت شده در حضور کلیت کننده های کلسیمی، آنتاگونیست های رسپتور های گلوتامیتی، بلاک کننده کانال کلسیمی وابسته به ولتاژ و مهار کننده مبادله کننده کلسیم/سدیم برای 6 ساعت نسبت به قطعات گروه کنترل به طور قابل توجه ای افزایش یافت. کاربرد مواد ذکر شده توانستند نشانه های مورفولوژیکی اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی از قطعات تیمار شده به طور قابل ملاحظه ای نسبت به این نورون ها از قطعات کنترل مهار نماید. علاوه بر این در حضور این مواد تعداد نورون های حرکتی به طور معنی داری (p<0/001) نسبت به گروه کنترل افزایش یافت. بعنوان نتیجه گیری، کاربرد کلیت کننده های کلسیمی، آنتاگونیست های رسپتور های گلوتامیتی، بلاکر کانال کلسیمی وابسته به ولتاژ و مهار کننده مبادله کننده کلسیم/سدیم نه تنها قابلیت حیات قطعات نخاع را افزایش دهد بلکه توانست اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی مهار و درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را بطور معنی داری افزایش دهد.